在試圖區(qū)分顯微鏡下觀察到的樣本細節(jié)時，數值孔徑（縮寫為‘NA’）是一個重要考慮因素。NA是一個沒有單位的數，與透鏡收集的光角度有關。在計算NA（見下文）時還考慮了介質的折射率，通過將載玻片或細胞培養(yǎng)容器的折射率與浸沒介質相匹配就可以分辨出樣本的更多細節(jié)。光從一種介質傳播到另一種介質時的行為方式也與NA有關（稱為“折射"）。本文還介紹了折射的簡要歷史，以及這一概念如何成為實現高NA的限制因素。

顯微鏡物鏡

如果您細看顯微鏡上的物鏡，您會看到鏡筒處銘刻有多種不同的信息和數字。除了放大倍數和光學校正外，您還將看到另一組沒有單位的數字。這就是物鏡上的數值孔徑（或‘NA’）（見圖1）。

物鏡的NA是相對重要并且與圖像分辨率相關。簡單來說，分辨率是指物鏡區(qū)分樣本細節(jié)的能力。沒有對應的高NA，高放大倍數的物鏡也無法對樣本的細節(jié)加以分辨。

簡單來說，顯微鏡物鏡的NA就是透鏡在與所觀察物體的固定距離內收集光的能力。光穿過樣本時，會以倒錐形進入物鏡。但樣本中的部分光會出現折射（和反射），這樣反過來形成的圖像會具有較高的分辨率，并且比具有較低NA的物鏡包含更多的細節(jié)信息。

孔徑角

圖1：NA位于放大倍數后面（這里是：40x/0.6）

孔徑角

物鏡前透鏡收集到的光錐角的最大徑向角度又稱為‘孔徑角’（見圖1）。除了增加NA外，圖像亮度也與孔徑角成正比。孔徑角隨物鏡焦距而變化，它與物鏡前透鏡在樣本聚焦時捕獲的從樣本發(fā)出的成像光線的最大角度有關。

孔徑角與物鏡焦距成反比。隨著焦距的減小，物鏡前透鏡所能收集的光量也會增加。換言之，如果物鏡距離樣本很近，那么物鏡可以收集到更多的斜射光線。應該說，孔徑角通常由物鏡內的光學元件決定，每個物鏡都有一個最佳焦距。打個比方，想象一下：如果您站在一扇門前，門上有一個鑰匙孔可以看到另一個房間，那么當您在遠處時只能看到房間里的一點點光和極少的物品。如果您把眼睛湊近鑰匙孔，您將會看到房間里更多的細節(jié)和光線，因為理論上您增加了眼睛的孔徑角。

通過物鏡來收集并形成的圖像亮度和圖像細節(jié)（分辨率）與孔徑角有關。來自樣本的光會連續(xù)通過蓋玻片與物鏡前透鏡之間的空氣或者穿過浸沒介質。

圖2：孔徑角（A）是由前透鏡收集的

光錐的最大縱向角。α是光錐角的一半

NA的計算

數值孔徑可以用下列公式來表達和確定：
在以上公式中，‘n’為蓋玻片和物鏡前透鏡之間的介質折射率（例如空氣、水或油）。‘α’符號與光錐角的半角有關并且可通過透鏡進行收集（即孔徑角；見圖2）。

圖3：物鏡的焦距越短則孔徑角越寬，

從而獲得更高的NA和分辨率

空氣的折射率約為1.0，而水的折射率為1.3，用于光學顯微鏡的一些浸油的折射率可以高達1.52。

折射

要*理解NA，先理解折射會比較有幫助。在光學和顯微鏡學當中，折射是指光波穿過樣本以及從樣本中傳來時改變了方向，這是由于光傳播經過的介質（例如空氣、玻璃、水或油）發(fā)生了改變。‘斯涅耳定律’中的公式就很好地對折射進行了描述。Willebrord Snellius（1580-1626）是荷蘭數學家和天文學家。他確定出計算地球半徑的新方法，還通過數學方法對折射進行了描述并因此名聲大噪。但他并不是第一個用數學方式描述折射現象的人，更準確地說，他只是“重新發(fā)現"了波斯數學物理學家Ibn Sahl 對于這種現象的描述。Ibn Sahl在984年的手稿中，就闡述了曲面透鏡和鏡子如何彎曲并聚焦光線。

斯涅耳定律中指出，入射光和折射光的角度之比等于光通過的折射率之比的倒數。

簡單地說，當光線從一種介質傳播到另一種介質時，它的速度會發(fā)生改變 – 例如當光從空氣傳播到水中時，光的速度會減慢。此外，當光以非90°的角度進入介質時，其速度的變化會導致方向改變。需要注意的是，光的頻率不會改變，但是波長將由介質的性質決定。

理論上，物鏡前透鏡收集的光錐的最大孔徑角為180°，α值為90°。由于90度的正弦值為1，因此能夠在空氣介質中從樣本上收集180°合成光的物鏡的理論NA值也為1。顯然，折射率是實現物鏡最高NA的限制因素。因此，高NA物鏡都會用浸泡介質代替空氣，如油或水。現實中，在樣本和物鏡前透鏡之間有空氣的情況下NA值不可能達到1，因此“干透鏡"（即非浸沒物鏡）的最高NA值接近0.95。這是因為大多數透鏡無法從樣本中收集180°的光，而最寬的角度約為144°。144°的正弦值為0.95而空氣的折射率為1.0，因此理論上最大值NA接近0.95。

高倍放大物鏡搭配較低的NA最終只能獲得較低的分辨率。很多顯微鏡企業(yè)在其物鏡當中盡可能將NA提高。所以如果您正在考慮為顯微鏡購買新的透鏡，那就要隨時考慮如何在自己的預算范圍內購買到NA最高的物鏡了。